Ambroise est né à Trèves, en Allemagne, sur la Moselle, où son père exerçait la charge de préfet du prétoire.

Un jour qu'il était enfant et dormait, un essaim d'abeilles couvrit sa figure. Elles entraient et sortaient de sa bouche. Les abeilles prirent ensuite leur envol et s'élevèrent en l’air. L'événement frappa son père qui dit : « Si ce petit enfant vit, ce sera quelque chose de grand. » En quittant son visage, les abeilles avaient laissé un peu de miel dessus. Ceci fut considéré comme le présage de son éloquence.

A Rome, il étudie le droit et la rhétorique et devint un brillant avocat.
En 370, il est à Milan en qualité de gouverneur de l'Emilie et de la Ligurie alors que de graves dissensions opposent chrétiens et ariens à propos de la nomination du nouvel évêque rendant nécessaire l'intervention du gouverneur.
Ambroise plait aux deux parties qui l'élisent évêque. Ambroise est baptisé le 30 novembre 374 et consacré évêque une semaine plus tard.

Ambroise a occupé le siège épiscopal de Milan de 374 à 397. Habilement et avec force, il défend les droits de l'Église face aux Empereurs Valentinien Ier, Valentinien II et Théodose le Grand, dont Milan est alors la capitale.

C'est auprès de lui qu'Augustin d'Hippone se convertit au christianisme.